分子克隆-一个例子
说起分子克隆，几乎每个做过质粒构建的伙伴都知道Gibson组装。这个方法太受欢迎了！记得刚进实验室的时候，师兄师姐教我构建质粒的方法是Gibson组装。当时实验室里的人都在用Gibson组装，我才知道高中生物课和本科生物课学到的经典酶切连接法早就过时了。后来看了很多文献，发现除了Gibson组装，其实还有很多有用的质粒构建方法，几乎与Gibson组装同时出现的金门组装就是其中之一。这两种方法都可以用于无缝克隆。
金门组装是一种新型的酶切连接方法[1，2]，不同于传统的酶切连接方法。传统的限制性内切酶连接法使用标准的II型限制性内切酶(限制性内切酶)(如Eco RI)切割DNA。这些限制酶通常识别4~8 bp的回文，在识别的序列内部切割产生粘性末端或平端(图1A)。金门装配使用IIS限制酶(如Bsa I)切割DNA。这些限制酶识别非回文序列，并在识别序列之外切割它们以产生粘性末端。(图1B)。
图1II限制性内切酶和IIS限制性内切酶切割DNA。
IIS限制性内切酶切割DNA产生的粘性末端通常是2或4个碱基。在连接反应中，粘性末端的碱基数量越多，连接产物的保真度越高。所以金门装配通常使用能产生4个碱基粘性末端的IIS限制性内切酶，如Bsa I、Bsm BI、Bbs I(图2)。NEB公司对这三种野生型限制性内切酶进行了分子改造，得到了三种识别序列相同但特异性更强的限制性内切酶，分别是Bsa I-HFv2、Bsm BI-v2和Bbs I-HF(图2)。这些限制酶的识别序列长度为6 bp，因此它们在DNA序列中出现的概率为1/4096。
图2三种IIS限制性内切酶的特异性
如图2所示，三种IIS型限制性内切酶的特异性可分别记录为BSA I(GGT tctc 1/5)、BSMB I(CGT tctc 1/5)和BBS I (GAAAGAC 2/6)。此外，还经常使用能产生3碱基粘性末端的IIS型限制性内切酶Sap I(GCTCTTC 1/4)[3]。虽然这种限制性内切酶产生的粘性末端较短，连接产物的保真度会略有降低，但识别序列长度较长(7 bp)，因此其出现在DNA序列中的概率为1/65438+。根据切割位点的顺序，Bsa I、Bsm BI和Bbs I可产生256种粘端，Sap I可产生64种粘端。
市场上有很多基于金门组装的克隆试剂盒，但是价格都很贵。我一直建议你自己买酶和试剂来准备反应体系。只要了解金门组件的工作原理和实验设计方法，就没有问题。下面我以Bsa I-HFv2为例，谈谈如何利用金门组装构建质粒。
设计引物
通过PCR引入Bsa I的识别序列，并将该识别序列添加到引物的5’端。为了保证限制性内切酶能稳定地与DNA双链结合并发挥切割作用，要在识别序列的末端加一个保护碱基。保护基的数量和类型是不固定的。为了简化引物设计，我们可以用TTT作为保护碱基(大部分限制性内切酶3 bp就够了，如果为了保险起见，保护碱基可以增加到6 bp。因为切割位点在识别序列的下游，可以是任何序列，所以有三种不同的引物设计方法，如图3所示。
图3设计引物的三种策略:N代表任意碱基，1234和5678代表两个不同的切割位点，可以利用PCR模板或引物的已有序列引入N和切割位点。
实验原理
(1) 2个DNA片段的连接
图4金色大门组件连接两个片段。
(2)四个DNA片段的连接
图5金门装配连接四个片段:1234，5678，ABCD和efgh代表四个不同的切割位点。
上面两张图分别是2段连接和4段连接的工作原理，其他段的连接也差不多。酶切和连接在同一反应体系中进行，可以用PCR产物作为底物(如图4和图5)，也可以先将PCR产物克隆到质粒载体中，再用质粒作为底物。在合适的实验条件和设计下，使用金门装配可以装配20个以上的DNA片段。下面这个小视频可以帮助你进一步了解金门装配的工作原理。
金门组件的工作原理
操作过程
(1)制备反应体系
①每个镶件的添加量可以根据载体的添加量以及载体和镶件的长度进行换算，这里提供了一个换算工具/#!/结扎；？②其他可用的核酸内切酶:BsmBI-v2(NEB #R0739，10U/？l)、BbsI-HF (NEB #3539，10U/？l)、萨皮(NEB #R0569，10U/？l)；③如果插入片段数为1~10，则使用10个单位；；如果插入片段的数量大于10，则使用20个单位；④如果插入片段数为1~10，则使用500个单位；；如果插入片段的数量大于10，则使用1000个单位。
(2)反应程序
注:37℃是BsaI-HFv2的最适反应温度。如果使用其他限制性酶，这个温度可能需要调整。例如，BsmBI-v2的最佳温度为42℃。
优势
与传统的限制性内切酶连接相比
(1) IIS限制性内切酶的切割位点在识别序列之外，因此在酶切过程中识别序列被去除，不必要的序列不会被引入连接产物中。
(2) IIS限制性内切酶对切割位点的序列没有要求，因此可以通过设计切割位点的序列来产生不同的粘性末端，这使得定向组装多个片段成为可能。
(3)由于识别序列不会残留在连接产物中，消化反应和连接反应可以在同一反应体系中进行，简化了实验过程。
与Gibson装配相比
(1)片段的连接过程不涉及序列降解和合成，因此连接产物的保真度更高。
(2)可以组装更多的DNA片段，适用于质粒文库。
(3)?可以组装具有同源序列或重复序列的DNA片段，例如，它可以用于构建表达多个sgRNA的质粒[4]。
(4)?可以构建标准化的合成生物元件，类似于生物砖。
需要注意的事项
(1)应选择合适的限制性内切酶，该限制性内切酶的识别序列不能出现在最终的连接产物中。
(2)设计引物时，识别序列和切割位点的方向要正确。
(3)当插入片段数量较多时，为了保证连接的特异性，需要合理设计切割位点的4 bp序列。
参考文献[5]中的表S7提供了切割位点的优化序列组合。
参考资料:
[1]恩格勒等人(2008年)？PLoS One？3，e3647。
具有高通量Capabilitydx.doi.org的一锅一步精确克隆方法
[2]恩格勒，c .等人(2009)？PLoS One？4，e5553。
金门改组:基于IIs型限制性Enzymesdx.doi.org的一锅DNA改组法
[3]惠特曼，l .等(2013)？吉尼特。英语。生物技术。？33, 42.
(PDF)使用System.www.researchgate.net伊莱克特载体快速、无疤痕地克隆基因片段
[4] Vad-Nielsen，j .等人(2016)？细胞分子。生命科学。？73, 4315–4325.
https://doi . org/10.1007/s 00018-016-2271-5 doi . org
[5] HamediRad，m .等人(2019)？ACS合成器。生物。？8, 1047–1054.
高效单锅无疤金门Assemblydoi.org