电子显微镜训练梅田

论述了电子显微镜的发展现状和历史，介绍了几种先进的电子显微镜的结构、原理及其在生物学领域的应用，并讨论了它们在组织学研究中的应用。关键词:电子显微镜；组织学研究简介:显微术是一种专门用于物质微小区域的化学成分分析、显微形态观察和微观结构测定的显微分析技术。20世纪30年代，透射电子显微镜的发明标志着电子显微技术的诞生，人们可以进一步研究物质的超微结构。电子显微技术在普通光学显微技术的基础上进一步拓宽了人们的观察视野，在各个领域发挥了重要作用，在科学领域得到了广泛的应用。在生物学研究领域，电子显微技术促进了组织学、细胞生物学、分子生物学等学科的发展，因此具有不可替代的崇高地位。

一、电子显微镜技术

1.1电子显微镜的定义和组成，简称电子显微镜，是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的精细结构以极高的放大率成像的仪器[1]电子显微镜由镜筒、真空装置和电源柜三部分组成。镜筒主要由电子源、电子透镜、样品架、荧光屏和探测器组成，通常自上而下组装成一列。①电子透镜:用于聚焦电子，是电子显微镜镜筒中最重要的部件。一般用磁性镜头，有时用静电镜头。它利用一个与镜筒轴线对称的空间电场或磁场，使电子轨迹向轴线弯曲形成焦点，其作用与光学显微镜中的光学透镜(凸透镜)聚焦光束的作用相同，故称电子透镜。光学镜头的焦距是固定的，而电子镜头的焦距是可以调节的，所以电子显微镜不像光学显微镜那样有可移动的透镜系统。大多数现代电子显微镜使用电磁透镜，非常稳定的DC激励电流通过带极靴的线圈产生的强磁场聚焦电子。②电子源:由释放自由电子的阴极、加速电子的栅极和环形阳极组成。阴极和阳极之间的电压差必须非常高，通常在几千伏到三百万伏之间。它能发射并形成速度均匀的电子束，因此要求加速电压的稳定性不低于万分之一。③样品架:样品可以稳定地放置在样品架上。此外，经常有装置可以用来改变样品(如移动、旋转、加热、冷却、拉伸等。).(4)探测器:用于采集电子信号或二次信号。

1.2基本原理不同类型的电子显微镜成像原理不同，但都是利用电磁场来偏转和聚焦电子束，然后根据电子与物质相互作用的原理来研究物质的结构。其中，透射电子显微镜产生的电子束被聚光镜会聚，均匀地照射到样品上的待观察区域，入射电子与样品物质相互作用。由于样品很薄，大部分电子穿透样品，其强度分布与被观察样品区域的形貌、组织、结构一一对应。从样品投射的电子被三级磁透镜放大，投射到观察图案的荧光屏上，荧光屏将电子强度分布转换为人眼可见的光强分布，从而在荧光屏上显示出与样品的形态、组织和结构相对应的图像。扫描电子显微镜(SEM)用线圈驱动的聚焦电子束对样品表面进行逐点扫描成像，成像信号为二次电子、背散射电子或吸收电子。二次电信号被探测器采集并转换成电信号，处理后得到反应样品表面形貌的二次电子图像。背散射电子成像反映了样品的元素分布和不同相组成区域的轮廓。此外，由于电子的德布罗意波长较短，分辨率远高于光学显微镜，可达0.1 ~ 0.2 nm，放大倍数从数万倍到数百万倍。

1.3技术发展史世界上第一台透射电子显微镜(TEM)是由德国科学家鲁斯卡和诺尔于1931年研制成功的。二战后，鲁斯卡继续研究和改进TEM，制成了放大倍数超过654.38+万倍的显微镜，并因此获得了诺贝尔物理学奖。英国工程师查尔斯在TEM的基础上，于1952年发明了世界上第一台扫描电子显微镜(SEM)。扫描电子显微镜主要用于观察高度差和粗糙度较大的厚样品，因此在设计上突出了景深效果，一般用于分析断口和自然表面，无需人工处理。然而，透射电子显微镜(TEM)突出了高分辨率。用TEM观察样品可以获得高分辨率的超微结构图像，在材料科学和生物学中有着广泛的应用，也是病理学的诊断工具。这项技术的关键是超薄切片的制备。之后，场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)、场离子显微镜(FIM)、低能电子衍射(LEED)、俄歇能谱仪(AES)、光电子能谱仪(ESCA)相继诞生，在各个科学领域的研究中发挥了重要作用。1981年，G. Binnig和H. Rohrer成功研制出世界上第一台扫描隧道显微镜(STM)，获得诺贝尔物理学奖。它的出现使人类首次能够实时观察到单个原子在物质表面的排列以及与表面电子行为相关的物理化学性质，被国际科学界公认为80年代世界十大科技成果之一。扫描隧道显微镜(STM)是一种新型仪器，它利用导体针尖与样品之间的隧道电流，用精密的压电晶体控制导体针尖沿样品表面扫描，从而在原子尺度上记录样品的表面形貌。其分辨率达到了1 nm ~ 2 nm，可用于研究各种金属、半导体和生物样品的表面形貌，以及表面沉积、表面原子扩散、表面粒子的成核和生长、吸附和脱附。STM出现后，发展了一系列工作原理相似的新的显微技术，包括原子力显微镜(AFM)、横向力显微镜(LFM)等。这些基于探针对样品进行扫描和成像的显微镜统称为扫描探针显微镜(SPM)。扫描探针显微镜是纳米计量、纳米表征和测量中最重要和最基本的方法。它可以以原子探针和待测样品表面为主要部件，完成X、Y方向上探针与样品之间的扫描，同时模拟Z方向上样品表面的起伏。利用探针与样品相互作用产生的物理量随样品表面起伏的变化来观察样品表面形貌。该仪器分辨率高，水平分辨率可达0.1nm，垂直分辨率可达0.01nm。它可以直接观察和确定样品的三维图像，可以在大气、真空甚至高温或低温的液体中进行观察。不接触样品即可检测，所以不会损伤样品，也不需要电子束照射，所以不会对样品造成辐射损伤。

二。中国电子显微镜技术的发展1958年，中国研制成功第一台电子显微镜，1988年，中国科学院白春礼、姚俊恩研制出中国第一台STM。[2]2000年，中国电子显微镜学会统计中国大陆不到2000套。中国加入世贸组织后，经济发展、科研、教育和产业结构都在升级。目前，中国的电子显微镜市场每年增长近100台。可以预计，未来几年中国电子显微镜的市场容量将位居世界第一。对于中国市场的电子显微镜，日本电子的市场份额超过50%，位居第一。其次是费(原飞利浦电子显微部)、日本日立(代理)、德国(原德国利奥)、日本岛津。国内厂商方面，主要是中科易科、南京江南光电和上海电子光学技术研究所，产品主要集中在低端扫描电镜市场。就整体市场情况来看，国产电子显微镜国内市场份额不到10%。可见我国国产电子显微镜还有很大的提升空间。从类型来看，扫描电镜占我国电子显微镜总数的63.61%，透射电镜占36.39%，可见扫描电镜在我国拥有更广泛的用户基础。[3]

三、电子显微镜技术的未来发展趋势

3.1远程电子显微镜技术20世纪90年代以来，随着计算机技术和网络技术的发展，逐渐出现了远程电子显微镜，可以将实验室中获得的实时信息展示给远程用户，使他们可以通过互联网实时观看样品图像，远程操作仪器完成实验。[4]远程电镜技术的关键在于图像采集、压缩和传输。在图像采集方面，现在的电子显微镜已经有了很大的进步。旧的电子显微镜多采用数码相机和视频采集卡采集图像，新的电子显微镜多采用VGA采集卡采集图像，成为未来的发展趋势。此外，使用软件收集图像的新方法也逐渐出现。在早期，JPEG图像压缩用于图像压缩，即远程用户看到的是一系列独立的静态样本图像。现在，随着技术的发展，MPEG4-4、H.264等视频压缩算法逐渐应用于样本图像的压缩。目前样本图像的传输主要是通过TCP和UDP协议，但是这两种协议占用的带宽太大，传输效果不理想。为了提高传输性能，正在研究专用数据传输系统“金字塔”网络传输模型和专有传输网络，这也是现阶段远程电镜的改进方向。1990年，卡尔·兹莫拉等人实现了扫描电镜样品图像的网络传输，首次建立了远程电镜样品图像实时传输系统。随后，美国大学纷纷建立自己的SEM远程系统。样本传输的效率也有了很大的进步。最初在800Mb光纤网络中，样本图像的传输效率是每17秒1帧。到2000年，在1~2Mb的网络中，样本图像的传输可以达到每秒5帧。技术上还有很大的提升空间。在我国，虽然高校和科研机构有数千台电子显微镜，但仍不能满足日益增长的应用需求。因此，远程电子显微镜技术的研究对我国具有重要的应用价值。

3.2低温电镜技术低温电镜技术是一种利用冷冻(物理)方法制备生物样品并进行观察的技术，因此在生物组织学中应用广泛。与常规电镜技术(化学方法)相比，它能最大限度地保持样品的生理状态，可用于研究生物大分子的动态过程和分析核组织的三维结构。

3.3低温电子显微镜下的三维重建技术电子显微镜的三维成像技术是电子显微镜与计算机完美结合的产物。它利用电子显微镜采集样品的二维投影图像，通过计算机处理重建样品的三维空间结构。三维成像技术广泛应用于生物学领域，尤其是蛋白质的三维结构分析。早期的三维成像技术主要使用重金属盐溶液对样品进行染色。