什么是细胞培养，基本要素是什么？

一、操作程序:

1.实验前，用紫外线照射无菌室和无菌操作台30-60分钟进行灭菌，用70%酒精擦拭无菌操作台，打开无菌操作台的风扇10分钟，即可开始实验操作。一次只处理一个细胞，以避免细胞的交叉污染。实验结束后，将实验物品从桌子上拿出来。如果需要继续下一个实验，用70%的酒精擦拭无菌操作台，然后让无菌操作台的风扇运转10分钟，才能进行下一个实验。

2.无菌操作的工作区域应保持清洁和宽敞。必要的物品，如试管、移液管或吸管等可以临时放置，其他实验物品用后要及时取出，以利于气体流通。实验物品在进入无菌手术台前，应用70%酒精擦拭。实验操作应在控制台中央的无菌区进行，不要在边缘的非无菌区进行。

3.小心取出无菌实验用品，避免污染。不要触摸吸管和吸头的头部或容器的瓶口，不要在开口容器的正上方操作实验。容器打开后，用手握住瓶盖，握住瓶体，倾斜45°左右，尽量不要把瓶盖的盖子朝上放在桌子上。

4.工作人员应注意自身安全，进行实验前必须穿实验服，戴实验手套。对人源或病毒感染的细胞株应特别注意，应选择适当级别的无菌手术台(至少两级)。在操作过程中，避免产生气溶胶，小心有毒试剂，如DMSO和TPA，避免尖锐物体伤人。

5.定期检查以下项目:CO2气瓶中的CO2压力；CO2培养箱内的CO2浓度和温度，水盘是否被污染；无菌操作台内气流压力是否正常，定期更换紫外线灯管、HEPA过滤膜和预过滤(300小时/预过滤，3000小时/HEPA)。

二、粉末细胞培养基的制备(以1L为例):

细胞培养液通常需要添加10%血清，所以粉末培养液的配制体积为900 ml，pH为7.2-7.4。单独加入碳酸氢钠。如果在液体培养基中直接添加碳酸氢钠粉末，会造成pH值误差或局部过碱性。因此，粉末培养基和NaHCO3粉末在混合前应分别溶解，然后用CO2气体调节pH，而不是强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子可能会影响细胞生长，培养基的pH值在储存过程中容易发生变化。

试剂和设备

1.纯净水(milli-Q水或二级或三级蒸馏水，水质非常重要)

2.粉末介质(1640，DMEM等。)

3.碳酸氢钠(适马S-4019)

4.电磁搅拌器

5.无菌血清瓶

6.0.22微米无菌滤膜

7.pH计

8.真空活门

9.二氧化碳气体

准备步骤

1.将粉末培养基溶解在700 ml milli-Q水中，并搅拌使其溶解。

2.称取适量NaHCO3粉末(根据培养基的种类不同而不同)溶于200ml Milli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3-5min。

3.将含有饱和CO2的溶解的NaHCO3溶液加入到溶解的液体培养基中并混合。混合溶液的pH值应在7.2-7.4，除非pH值偏差过大，否则不必用酸碱调节。如果碱性太强，可以引入CO2气体来调节pH值..当培养基真空通过滤膜时，pH会增加0.1-0.2。

4.用0.1或0.2 mm无菌滤膜过滤灭菌，同时分装于无菌容器中，标明培养基的种类、日期、瓶号，4℃保存(也可在培养基中加入血清过滤)。

5.制备的培养基必须进行生长和污染试验。

需要注意的事项

1.液体培养基在4℃冰箱中避光保存，实验前在37℃水槽中加温。

2.液体培养基(含血清)贮存期为六个月，在此期间谷氨酰胺可能分解。如果细胞生长不良，可以加入适量的谷氨酰胺。