植物组织培养中如何防止污染

(1)改善环境条件。接种室和培养室应定期消毒净化，接种前工作台或接种箱应开启30min以上。培养室的相对湿度应控制在70%左右。相对湿度过高时，可用除湿机除湿。

(2)接种人员的培训非常重要，应严格执行无菌操作。接种所需工具在使用前必须严格消毒。在洁净工作台的操作区，不要放太多要用的材料，以免气流受阻。还要定期检查洁净工作台的工作质量[8]。

(3)严格检查接种材料。消除被真菌和细菌污染的接种材料。

(4)经常检查灭菌器的灭菌质量，发现问题立即修复。消毒锅的压力表降到零后不能马上拿出来。由于冷热空气作用产生的负压效应，使外界环境中的冷空气被吸回已灭菌的培养瓶中，造成真菌污染。为避免这种现象，应在锅稍微冷却后，将灭菌后的培养瓶从锅内取出[9]。

(5)检查培养容器是否有问题。培养容器通常用塑料盖、橡皮塞、棉塞、薄膜等密封。塑料盖用久了容易老化，密封性差，也会造成污染。林升等人配制了一种“4号消毒液”对瓶口进行消毒，可将培养基污染率控制在0.3%以下[10]。

传代培养中污染的预防和控制

初期获得的无菌材料理论上是无菌的，但在后期或继代培养中也会被污染，除了操作不慎，还可能被培养室内螨虫传播的真菌污染。这种污染可以从两个方面来预防:(1)扩大再生产要有合理的程序。在获得原始无菌培养产品后，其中一部分要作为“原种”保存，然后进行批量繁殖和复检，再提供批量生产。(2)可以在培养基中加入抗菌剂来防止[3]。徐万芳等人在金线莲组织培养中使用多菌灵抑菌促生，效果明显优于甲霜灵、甲基硫菌灵及其混合物。生长在含多菌灵培养基中的金线莲未被微生物污染，杀菌率为100%，无白化苗，苗健壮[11]。

植物内生细菌具有很深的潜力，不能通过表面消毒来消除。有时，在外植体的初始培养中，包括前几代的继代培养中，在培养基上不容易被肉眼检测到。随着继代次数的增加，细菌量逐渐积累发展，然后出现在培养基上[12]。黄小容等人认为植物组织培养中细菌污染的原因是休眠细菌孢子萌发的结果[13]。通过在培养基中添加抗生素、培养茎尖和降低PH值，可以预防和减少细菌等内生细菌的污染。

王一菲等在彩色芋头快繁至第4-5代时添加200mg/L青霉素GK，可有效抑制内生菌的生长，而不影响繁殖系数[14]。在长春藤的组织培养中，翟建忠等人用链霉素抑制内生细菌黄单胞菌。其效果优于庆大霉素和头孢唑林钠。在培养基中同时使用这两种抗生素有利于防止细菌产生耐药性，长期控制细菌污染的发展。然而，链霉素剂量的增加会对植物产生毒性[15]。

在培养基中添加抗菌剂时，选择合适的浓度非常重要。低浓度会效果差，高浓度容易毒害植株，影响增殖或使培养的材料变黑，造成死苗和白化苗。两种或两种以上抗生素联合使用，可预防和控制细菌的耐药性。抗生素和多菌灵一般不耐高温，需要过滤灭菌，生产中不方便添加。苯甲酸钠、山梨酸钾、丙酸钠是食品中常用的防腐剂，耐高温高压，便于在组织培养生产中使用。

植物材料中的内生菌也可以通过重复茎尖培养来去除。由于病原菌在植物体内的分布是不均匀的，茎尖分生组织通过维管束传递是无菌的，通过反复茎尖培养，无论是内生细菌还是病毒都可以被去除。

除欧文氏菌外，大多数细菌在培养基PH小于4.5时不能生长。在紫苑、鸢尾、蔷薇的组织培养中，将培养基的PH值从5.8调整到3.9 ~ 4.3，可以防止大量的细菌污染[7]。胡青等在低PH值(3.10)的水中培养，并改善容器的通风条件，可使细菌污染严重的绿巨人块正常增殖，对单株生长无害。生根苗比例高于常规固体培养，基本解决了细菌污染严重后的产菌问题[16]。

对于被污染的培养物，有时会因为植物材料的稀少或反复出现而耗费大量时间，较大的植株也可以切割消毒后再次接种。李等分别用400万或600万单位/L青霉素无菌水溶液浸泡银白杨组织培养中的细菌污染苗60min或40min，可有效防止组织培养中的细菌污染。处理后的幼苗继代培养时，没有反复的细菌污染，幼苗分化能力强。生根时根系发达，移栽成活率高[17]。Mars等人证明，如果继代培养中只有真菌污染，可在3%多菌灵无菌溶液中浸泡0.5h以上，用无菌水冲洗后接种或不经无菌水冲洗直接接种即可消除真菌污染。如果细菌和细菌、真菌同时污染，可以用HgCl2消毒法重新建立无菌育苗体系，将污染的幼苗切成长茎段作为外植体，用自来水冲洗0.5h，然后在超净工作台上用乙醇和HgCl2短时间处理[18]。

4.减少培养基中的有机成分

培养基中有机物的存在是造成污染的重要原因，去除有机物也是减少污染的一种方法。在阿月浑子的组织培养中，宋凤辉等人去除了有机成分(如VB1、VB6、烟酸等。)在培养基中，经2 ~ 3代培养后，能抑制细菌的生长，对丛生芽的生长和增殖无影响。原因是这些都是某些细菌生长的必要物质。去除这些有机物后，细菌无法生长发育，死亡逐渐减少[19]。日本Toyuki Kozai教授首创的植物无糖组培快繁技术，完全去除培养基中的有机成分，输入可控量的CO2气体作为碳源，通过控制环境因子促进植物的光合作用速率，使植物由异养转化为自养，使植物生长良好，污染率明显降低[20]。由于去除了糖分，组培苗的培养由玻璃瓶变成了箱式容器，整个培养室也可以作为培养容器，甚至不需要严格的无菌操作，污染也很小。这项技术至少在很多植物组培苗的生根促进阶段是非常成功的。

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