甲型流感病毒H1N1实验室检测技术方案本方案旨在
一、标本采集类型和要求
1，建议采集的呼吸道标本类型
发病后应尽快采集以下标本:鼻拭子、咽拭子、鼻吸出物和鼻灌洗。气管插管患者还应收集气管吸出物。标本应置于无菌病毒采样溶液中，并立即用冰块或冰排保存或置于4℃(冰箱)中，并立即送至实验室。(临床样本采集人员和实验室检测人员的感染控制指南请参考相关文件。)同时填写H1N1的疑似人感染病例样本清单。(附表1)
2、棉签的选择
标本应使用带有合成纤维头(例如，聚酯纤维)和铝或塑料手柄的拭子。不建议使用棉签和木柄。标本采集管应含有3 ml病毒取样液(含蛋白质稳定剂、防止细菌和真菌生长的抗生素、缓冲液)。
3、临床标本保存要求
储存在4℃(不超过4天)或-70℃或以下。有条件的实验室应保持在-70℃或以下。不应储存在-20℃下。
4、标本包装处理
标本送到实验室后，应立即处理，避免反复冻融。原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复检。
5.标本的运输
人感染甲型H1N1疑似病例定为A类，用UN2814包装运输。填写《疑似人感染A型H1N1感染病例送检单》(附表2)。
第二，核酸检测
基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病的应急工作中发挥了巨大作用。
1，基于实时RT-PCR的新型甲型流感病毒H1N1的检测(引物和探针序列由疾控中心设计)；
4月29日，世卫组织网站公布了疾控中心针对这种甲型流感病毒设计的实时RT-PCR引物和探针。该实验用于检测疑似甲型流感病毒的呼吸道样本。因此，建议使用这种实时RT-PCR方法首先筛查甲型流感病毒，排除季节性流感病毒和H5N1。实时RT-PCR方法见附件3(中文翻译版)和附件4(英文原版)。
2.基于RT-PCR(国家流感中心设计的引物序列)检测新型甲型流感病毒h 1n 1；
目前国家流感中心已设计RT-PCR检测新型甲型流感病毒H1N1。RT-PCR的方法见附件5。
第三，病毒的分离和鉴定
鸡胚和/或MDCK细胞可用于流感病毒的分离。具备相应条件的网络实验室应当在收到标本后24小时内进行病毒接种。具体方法见附件6和附件7。
四。甲型流感病毒H1N1对实验室人员的生物安全
(1)实验室水平和个人防护
1.在BSL-2实验室对从疑似感染甲型流感病毒H1N1的患者采集的临床标本进行诊断实验。所有取样操作应在生物安全柜(BSC)中进行。遵循生物安全3级个人防护。
2.从疑似甲型流感病毒(H1N1)感染患者采集的临床标本的病毒分离培养应在BSL-3实验室进行，并遵循生物安全三级个人防护。
(2)健康监测
1，所有人员自测发热等症状。
2.甲型流感病毒H1N1的症状包括咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如果你感到不适，你应该立即向你的上级报告。
3.如果任何人在没有防护的情况下暴露于甲型流感确诊病例(H1N1)的临床标本或活病毒，应在暴露后7天内考虑使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒预防。
动词 （verb的缩写）附表和附件
附表1疑似人感染甲型H1N1样本表
附表2疑似人感染A型H1N1感染的标本
附件3:实时RT-PCR检测甲型H1N1流感病毒操作规程(2009年版)(中文)
附件4:实时RT-PCR检测甲型H1N1流感病毒的操作规程(2009年版)(英文)
附件5:用RT-PCR检测甲型流感病毒
附件6:甲型流感病毒H1N1鸡胚分离方法
附件7:甲型H1N1流感病毒MDCK细胞的分离方法
附表1
姓名、性别、年龄、职业※现住址、发病日期标本#
物种标本数量
(g或ml)采集
日期备注※选项:参考传染病报告卡。
#选项:A鼻咽拭子，B鼻咽抽吸物，C鼻腔灌洗液，D鼻腔抽吸物，E气管抽吸物，F其他(如果是其他，请在表格中注明)。
采集人员:采集单位(盖章):
附表2
姓名、性别、年龄、职业※、现住址、发病日期#
样本数量*
(g或ml)采集
日期备注※选项:参考传染病报告卡。
#选项:A鼻咽拭子，B鼻咽抽吸物，C鼻腔灌洗液，D鼻腔抽吸物，E气管抽吸物，F其他(如果是其他，请在表格中注明)。
*标本数量:如果同一标本有多个包装，请注明。
填表:送样时间:单位(盖章):
附件3
实时RT-PCR检测甲型流感(H1N1)的操作规程。
中文翻译(请同时参考英文原文)
请注意:请参考试剂盒供应商提供的系统建立说明。本规定中的制度仅供参考。
美国疾病预防控制中心猪流感实时RTPCR检测操作规程(2009版)
本程序的所有权属于疾病控制中心，并授权公共卫生实验室在紧急情况下使用。本规定不得用于商业活动或营利目的。
一.概述
(一)前提
这个程序是基于对rRT-PCR方法的基本掌握。
(2)实验原理
实时荧光定量RTPCR检测猪流感的方案是使用一套寡核苷酸引物和TaqMan & amp；reg呼吸道样本或体外培养物中猪流感病毒的探针、定性检测和鉴定。InfA引物和探针设计用于检测甲型流感病毒，swInfA引物和探针可特异性检测所有猪流感A病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感H1亚型病毒。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪流感感染病例的呼吸道样本..
(3)使用条件
一步定量RT-PCR 96孔板热循环系统。
(4)生物安全要求
样品处理应在相应的生物安全实验室完成。
(5)样品要求
1，呼吸道样本
支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物、痰、鼻咽或口咽灌洗液或拭子。拭子样本中使用的拭子顶部应由人造材料(如聚酯或聚酯)制成，手柄应由铝或塑料制成。不建议使用棉头木柄的棉签。藻酸钙拭子取样是不可取的。
2.排除标准
1)未储存在2-4°C(≤4天)或-70°C或以下的样品。
2)以上未列出的其他不合适的样品。
(6)核酸提取
RT-PCR的扩增效率取决于样品模板RNA的质量和数量。RNA提取操作应在核酸纯度合格后用于样品实验。商业操作程序包括QIAAMP &；reg病毒RNA提取试剂盒；reg小试剂盒(QIAGEN公司)、罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒、MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II、罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下可以提取高纯度的RNA。
(7)免责声明:所提及的制造商名称仅作为示例，不代表其获得了CDC的认可。
二、实验材料
(1)试剂
1，一步荧光定量RT-PCR探针试剂盒；
2.分子无菌蒸馏水(不含RNase和DNase)；
3.正向和反向引物(40 μm)；
4.双标记探针(10 μm)；
5.阳性对照。
(2)供应
1，实验室记号笔；
2.微量离心管栅，96孔0.2ml PCR反应管；
3、20μl和200μl可调移液器和过滤头；
4.0.2ml PCR反应管平板；
5.光反应盖板；
6、无菌、无核酸酶1.5 ml微量离心管；
7.一次性无尘手套。
(3)仪器设备
1.微型离心机；
2.涡流振荡器；
3.实时荧光定量PCR检测系统，包括96孔热循环反应板。
三、操作程序
(1)准备工作
1.避免样品污染
由于荧光5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性的产生。建议采用以下污染预防方法:
1)实验准备和核酸提取使用独立区域；
2)特殊设备(如移液器、微量离心机)和耗材(如微量离心管、吸头)用于实验准备和核酸提取；
3)实验结束后穿戴干净的工作服，使用新的一次性无粉手套；
4)在不同的样品操作之间以及在怀疑污染的情况下更换手套；
5)试剂和反应管的盖子应尽可能关闭。
2、仪器准备
工作台、移液器和离心机必须用清洁剂清洁和净化，如5%漂白剂、“DNAzap”或“RNase away &；reg”以降低核酸交叉污染的风险。
3、试剂准备
注意:在测试过程中，将所有试剂低温保存在冰架上。
1)引物和探针
(1)将包装好的冷冻引物和探针融化(融化后的探针在2-8℃的暗处最多可保存3个月，不要反复冻融探针)；
(2)涡旋振荡引物和探针；
(3)引物和探针瞬时离心，然后放在冰架上。
2)用于2)实时RT-PCR的试剂
(1)把Master Mix和酵素放在冰架上；
(2)熔化2×反应混合物；；
(3)混合2×反应混合物；上下颠倒；
(4)立即离心2倍反应混合物和酶，并将其放在冰架上。
4.检测RT-PCR的每一步。
1) RNA提取物分别用引物和探针检测:INFA、SWF Lua、SWE H1 (SWH 1)和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探针以人RNaseP基因为靶基因，因此可以作为人核酸的内部阳性对照。
2)为每个过程中包括的所有引物和探针建立无模板对照(NTC)和阳性模板对照(PTC)。
3)人类样本质控品(HSC)提供二级阴性质控品，以确认核酸提取过程和试剂的完整性。
5.建立反应
将反应检测混合物充分混合，然后加入到96孔板中。然后，将水和提取的核酸或阳性模板对照(PTC)加入适当的实验反应和对照中。
1)为每个引物和探针标记一个1.5ml微量离心管；
2)确定每个已建立反应的反应数(n)。考虑到NTC、PTC、HSC反应和吸附误差，需要制备过量的反应混合物。详情如下:
(1)如果样本数(n)的范围是1到14，那么n = n+1；
(2)如果样本数(N)大于15，包括对照，则N=n+2。
3)主混合物:计算添加到每种引物/探针反应混合物中的每种试剂的量。计算如下:
*请参考套件供应商提供的系统建立说明。
4)加水后，上下吹气使反应混合物混合均匀，无漩涡振荡。
5)离心5s，使混合物聚集在试管底部，然后将试管放在冰架上；
6)准备一个板状反应管或96孔板，放在冰架上；
7)每个主混合液每个孔吸20μl，每行按顺序进行，如下图所示:
实验建立的例子:
实验样本示例:
注意:在添加任何样品之前，应添加阴性模板对照(NTC)(1列)以测试主混合物中的污染。应在待测样品(11列)后添加HSC，以检查样品制备或添加过程中的交叉污染。阳性模板对照(PTC)应加在所有样本和阴性模板对照(NTC)之后。
8)在将培养板移动到核酸处理区域之前，在实验设置区域中的反应板的第一列中进行NTC反应。如上所述。
9)吸取5μl无核酸酶的水到NTC孔中，并盖住NTC孔。
10)覆盖反应板，并将其移至核酸处理区。
11)将装有样品的试管涡旋5s，并瞬时离心5s；
12)将提取的核酸样品放在冰架上；
13)如上所述，样品要按列加入，第一个样品5μl要吸到所有标有该样品的孔中(如上表所示样品“S1”)。不同样品之间需要更换枪头。
14)加样后的孔要盖好，这样有利于防止样品的交叉污染，也便于操作人员记录加样的具体过程；
15)为了避免交叉污染，必要时更换手套；
16)对其余样本重复步骤13-15；
17)向HSC孔中加入5μl HSC样品(11列)。盖住HSC孔。
18)最后，向所有PTC孔中加入5μl阳性模板对照RNA，并覆盖PTC孔。
19)如果用的是8管的条形板，每条都要贴标签标明每个样本的位置(不要标反应管顶部！)。瞬间离心条管10-15s，然后放在冰架上。如果使用培养板，4℃离心500g 30s，放在冰架上。
6.RT-PCR扩增条件
反应体系为25ul，反应条件如下:
注意:荧光信号(FAM)应该在55度的步骤中收集。
*具体扩增条件请参考试剂盒供应商提供的说明书。
7.解释/检查
1)探针/引物阴性对照反应中得到的荧光生长曲线不应超过阈值线。如果一个或多个引物和探针的阴性反应是假阳性，样品可能已经被污染。然后整个实验过程无效，严格按照步骤规则重复实验。
2)在37个周期或之前，所有临床样本的RP响应曲线应超过阈值线，这表明已经从人RNase P基因中扩增出足够量的RNA，且样本质量合格。但是，由于初始临床样本中的细胞数量较少，一些样本可能没有阳性结果。同时，从动物/鸟类或通过细胞培养获得的样品在RP反应中经常没有结果或结果微弱。如果RNase P在所有临床样本中均为阴性，则意味着:
(1)临床材料核酸提取不当导致临床样本RNA丢失或RT-PCR抑制剂残留污染；
(2)没有足够的人体细胞用于测试；
(3)方法制定和实施不当；
(4)试剂和仪器。
HSC组在40个周期内，InfA、swFluA和swH1探针的荧光生长曲线不应超过阈值线。如果任何一种流感特异性探针的生长曲线超过阈值线，则有以下解释:
(1)可能是由于RNA提取试剂的污染。实验前确保RNA提取试剂正确。
(2)交叉污染发生在2)RNA提取或样品添加期间。严格按照操作规程的要求重复实验。
(3)在40个循环之前，PTC反应的INFA、SWNFA、SWH1和RP反应应呈阳性结果。如果没有产生预期的阳性结果，则视为无效，应严格按照操作规程重复实验。确定PTC反应失效的原因，修改并记录错误原因和更改方案。不再使用不产生预期结果的PTC试剂。
(4)当所有质控品均符合要求时，如果InfA反应生长曲线在40个循环内越过阈值线，则认为样品为甲型流感病毒阳性。如果甲型流感病毒呈阳性，Univ SW和/或SW H1也可能呈阳性。如果InfA和特定亚型反应(swInfA和swH1)的反向生长曲线在40个循环内越过阈值线，则认为样品对猪流感病毒A/H1呈阳性。如果样本只对InfA和一种亚型呈阳性，或只对InfA呈阳性，请联系CDC寻求进一步指导。
(5)在所有质控品均符合要求的前提下，如果待检样品的所有InfA反应在40个循环内均为阴性，则该样品视为阴性。
8.限制和规定
1)实验人员在实际操作前要经过操作规程和测试结果分析的培训，熟练掌握后才能进行实验。
2)当样本量不足时，可能产生假阴性结果，可能是由于采集、运输或处理不当造成的。
3)如果反应中有太多的DNA/RNA模板，也可能出现假阴性。如果样品的RP反应被抑制，提取的RNA可以被稀释2倍或更多倍(例如，1: 10或1: 100)以重复实验。
9.评论
引物和探针在英文版P7中显示。
附件4
实时RT-PCR检测和鉴定甲型H1N1流感病毒的操作规程。
(英文版)
附件5
RT-PCR检测新型甲型流感病毒H1N1
一.目的
对采集的可疑病例样本进行检测，筛查甲型流感病毒H1N1，排除季节性流感病毒H1N1。
二、引物NIC引物名称碱基组成目的片段大小备注flu afula-M-f 30 ttctaaccgagggtcgaaacg 235 BP通用检测引物Flua-M-r 264 aaaggcgtctacgctgcag h 1hah 65 438+0f 1147 aagagcacatatgccat 527 BP h 1n 1通用引物h 1r 1r 6543868 ACTGGACTCTGCTGGAAC 327 BP人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物h 1HA r 1094 aatgaaccggcaatgtcc SWH 1HA-1SW-h 1F。786 aataacattagacacactgg 153 BP甲型流感病毒的引物SW-h 1n 1r 920 aggctgtttatrgcac RNase F agattgga CCT GCG。AGC G约80bp，与实时PCR中的RnaseP引物一致。CGG CTG TCT CCA CAA GT三。材料和仪器。
1，RNA提取试剂盒qiagen rneasy迷你试剂盒(目录号74104)
2.β-巯基乙醇(适马β-巯基乙醇批号062k0115)
3.70%乙醇
4、RT-PCR试剂盒:QIAGEN一步法RT-PCR试剂盒(目录号210212)
5、核糖核酸酶抑制剂(Promega目录号N2111)
6.引物检测
7.Axygen 1.5mL离心管，货号:MCT-150-C
8.Axygen 0.2mL PCR管，货号:PCR-02-C。
9.带滤芯的Axygen 10微升、100微升、200微升、1000微升针头。
10，10微升，100微升，200微升，1000微升取样器
离心机11，转速14K可调；
12，涡流混合器:
13，生物安全柜:二级生物安全柜。
14，PCR仪:
15，琼脂糖:Genetech(上海)有限公司经销的biowest琼脂糖，批号101685。
16，核酸染料:
17.电泳液:5×TBE电泳缓冲液目录号9009032718。电泳槽和电泳设备。
四、实验步骤
(1) RNA提取
1.根据样品数量分装RLT溶液:从试剂盒中取出RLT溶液，分装于1.5mL离心管中，每管500μL(在系统准备区操作)。
2.加入100μL采样液(鼻拭子、咽拭子、胸腔积液等。)或病毒培养物(鸡胚尿囊液或细胞培养液)注入生物安全柜中的RLT液体管中，并充分混合。
3.每管加入5μL β-巯基乙醇，混合后依次加入600μL 70%乙醇，充分混合。
4.从试剂盒中取出2mL带过滤柱的收集管，打开包装并做好标记。向过滤柱中加入600μL步骤(3)中的混合液，以65438±02000 rpm离心65438±05s，弃去收集管中的离心液。
5.将过滤柱放回收集管上，以12000转/分的速度将步骤(3)中剩余的混合液全部吸入过滤柱，离心15s，弃去离心液。
6.向过滤柱中加入700μl washbuffer rw 1溶液，12000rpm，离心15s。
7.从QIAGEN RNeasy Mini试剂盒中取出一个干净的2mL收集管，将离心过滤柱移至一个新的收集管中，加入500μL洗涤缓冲RPE溶液，12000rpm，离心15s。
8.弃去收集管中的离心液，然后在过滤柱中加入500μL洗涤缓冲RPE液，以13000~14000rpm离心2分钟。
9.将滤柱移至干净的1.5mL eppendorf管中，向滤柱中加入30~50μL无核糖核酸酶的水，室温下静置1~3min。
10，12000转/分，离心1分钟，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或保存于-20℃以下。
注意:在使用RPE缓冲液之间加入44毫升无水乙醇。
(2)反应体系的准备
1，实验设计:
样本RNA的检测
质量控制参数:
阴性对照:无菌水(标本提取RNA时，与标本同时提取无菌水。)
阳性对照:已知病毒RNA
2.PCR反应系统的制备(在系统制备区制备反应溶液)
1)根据下表添加试剂:
PCR反应体系的组分体积(μL)无RNase水
5×RT-PCR缓冲液11.9×n
5×n 10mm dntp mix 1×nen zyme mix 1×nrna se抑制剂0.1× nUpstream引物0.5× nDownstream引物0.5× nTotal 20×确定每个已建立反应的反应数(n=要进行的PCR管数，包括阴性反应。考虑到阴性无模板对照、阳性对照和误差，需要制备过量的反应混合物。详情如下:
(1)如果样本数(n)的范围是1到14，那么n = n+1；
(2)如果样本数(N)大于15，包括对照，则N=n+2。
2)将上述反应液混合均匀，分装于0.2mL PCR管中，每管20μL，分别标记。
3)添加RNA模板(在核酸提取区)
将模板添加到上述单独包装的PCR细管中。首先加入阴性对照试管(5μL无菌水)，然后加入样品RNA(每管5μL)，最后加入阳性对照RNA(每管5μL)。
3.RT-PCR反应
将反应管与模板混合均匀，短时间离心，放入PCR仪中进行RT-PCR。
扩增，反应程序如下:温度(°c)，时间循环数60℃1min 1min 50℃30min 95℃15min 94℃30s 3552℃30s 72℃1min 72℃7min 65438。
1)2.0%琼脂糖凝胶的制备:称取2.0g琼脂糖，倒入耐热玻璃瓶中，加入100 ml电泳液(1× TBE)，轻轻搅拌，加热至琼脂糖完全熔化。当琼脂糖胶温度降至50 ~ 60℃左右时，加入核酸染料，轻轻搅拌(无气泡)。当胶温降至50℃左右时，倒入制胶板，插入电泳梳。胶水完全凝固后(约30 ~ 60 min)，拔出梳子。
2)将制备好的电泳凝胶放入电泳槽中(有梳孔的一端在阴极)，倒入电泳液(1×TBE)浸泡凝胶表面。
3)分别取10μL PCR产物，加入2μL上样缓冲液(6×上样缓冲液)，混匀，然后加入电泳凝胶孔中(先加入5 μ l标记物(DL-2000)，然后依次加入样品PCR产物，再加入阴性对照产物，最后加入阳性对照产物)。
4)电泳电压为100V，大约30 ~ 40 min后会看到结果。
5)将电泳凝胶放入凝胶成像系统观察结果并拍照。
5、结果判断
在系统成立的情况下，即阴阳两界参照正常的情况下，每条引物所代表的含义如下:PCR引物样品1样品2样品3样品4样品5样品6 flua _ +++/-h 1HA _+/-huh 1HA _ _+_+/-SWH 1HA-1 _ _+/-RNA sep +++++结果判断非流感
非H1N1亚型人季节性H1N1亚型猪H1N1亚型流感病毒。
送到国家流感中心复查。送到国家流感中心检测的样本不是人源的/样本中细胞很少/实验或仪器有问题。